（四）菌毒种库的建立和保存
　　原始种子批是指已适应到可生产疫苗的细胞或培养基，可稳定传代、具有良好的免疫原性、并经过检定可用于疫苗生产的菌毒种。应提供原始菌毒种代次、滴度，添加的保护剂的名称和浓度、存储条件等资料。种子批的建立应符合现行版《中国药典》“生物制品制品生产检定用菌毒种管理规程”的要求，应对种子批进行菌毒种的传代和限定代次的研究，以证明主种子和工作种子批在规定代次内的生物学特性与原始菌毒种的一致性。
　　1．应提供候选菌毒种研究资料
　　在建立原始菌毒种库前应考虑候选菌毒种的研究：包括收集不同地区的（不同地域、发病率和民族）、不同时期的（近年与往年）、不同年龄和性别、疾病不同症状或严重程度、不同样本采集方式或来源（如血液、脑脊液、咽试子、漱口液、痰液、尿液、粪便等）的至少10个以上菌毒株进行生物学等研究和比较，分析其异同点，为建立菌毒种库提供依据。
　　2．三级种子库建立的研究资料
　　选择由多个候选菌毒种筛选获得的有代表性的2-3株菌毒种，用适宜的方法进行毒株的纯化，如空斑形成试验，挑取遗传稳定性与原始种子一致的，至少在主要保护区域核苷酸及氨基酸序列一致的毒株。同时进行三级种子批建立和工艺适应性、免疫原性和免疫效果比较研究。分析在种子批建立传代过程中不同菌毒种的遗传稳定性、病毒滴度及免疫原性资料；比对不同菌毒种对发酵、培养、收获、纯化等生产工艺和灭活工艺的适应性；考核不同菌毒种的免疫原性和免疫效果；对不同菌毒种的交叉保护水平和能力进行比较研究，确定交叉保护范围广、诱导免疫应答能力强的毒株。通过以上研究结合疫苗配方探讨，综合判断、确定应用于疫苗生产的最佳菌毒株。
　　原始种子、主种子、工作种子及疫苗代次的毒株遗传稳定性应保持一致。
　　（五）菌毒种的检定
　　1．鉴别试验：可采用血清学、生物学、核酸序列分析等方法证明为该菌毒种。明确该病原体及其它相关生物分子的基因序列及结构，并与我国主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明确其血清型、亚型和/或基因型，对该种基因型或血清型的流行情况进行分析，若存在不同的血清型或基因型，应对所选择的血清型或基因型与其它血清型或基因型交叉反应或交叉保护性进行分析和研究。对某些病原体，即使菌毒株为同一基因型或同一血清型，也应对不同菌毒株的抗原性、免疫原性以及交叉保护能力进行比较。
　　2．纯菌检查：按照现行版《中国药典》的要求进行，应符合规定。
　　3．外源因子检查：按照现行版《中国药典》的相关要求进行，应符合规定。
　　4．感染性滴度：应能达到按生产工艺要求顺利生产合格疫苗的要求。应建立测定菌毒种感染性滴度的方法和标准，并提供这些感染性滴度与疫苗有效性之间的相关性数据。
　　5．免疫原性检查：菌毒种的免疫原性是衡量该疫苗是否有效的重要指标，应制定和建立测定菌毒种免疫原性的有效方法和标准，以评估该候选菌毒种能否进行疫苗生产。
　　6．减毒特性
　　（1）如研制减毒活疫苗应对原始菌毒株的生物学、血清型、基因型和免疫原性进行研究；应提供减毒方法、减毒过程、减毒程度和减毒后的生物学、血清型、基因型和免疫原性及减毒稳定性资料，并进行减毒前后的特性对比，尤其要对减毒后的安全性和免疫原性做出确切的结论。
　　（2）应建立减毒特性指标的验证方法、动物模型和减毒后安全性的标准以及检测方法和警戒毒力回复的依据等。
　　（3）注射剂的减毒活疫苗，除一般的外源因子检测外，还应验证无逆转录病毒的污染。该验证方法可采用PERT法等。
　　（4）如已知该病毒具有嗜神经毒性，其验证要求可参考《IABSScientificworkshoponneurovirulencetestforlivevirusvaccines,WHO,31January2005》。